（文章篇）S4E04：说了你们又觉得在tree new bee的外泌体

昨天，“如何简单粗暴发6分文章”引发了一大波的热（tu）议（cao）。呵呵。

如果，觉得不够逼格，那么可参看下文了。

Exosome-Transmitted lncARSR PromotesSunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA,(Cancer Cell, May 9, 2016)

本文是二军大王红阳院士作为通讯作者，在cancer cell上最新发表的一篇文章。

先上机制图：

在苏尼替尼耐药RCC细胞中，lncARSR通过竞争性结合miR-34、miR-449促进苏尼替尼耐药，并能上调AXL、c-MET表达，激活STAT3、AKT、 ERK（存活）通路。另外，激活AKT能诱导FOXO1、FOXO3a磷酸化-降解，其结果导致lncARSR在转录上去抑制，从而形成了一个正向反馈回路。另外，lncARSR可以被包进外泌体中，并且可以由苏尼替尼耐药的RCC细胞分泌，传播耐药性到受体细胞中。

对照“小张聊科研”前几季的内容，本文有如下关键词：

a、组蛋白去乙酰化

b、外泌体

c、miRNA海绵

d、完整的预后数据

e、正反馈回路

本文主要内容有：

1、发现并验证lncARSR

2、lncARSR作用方式

3、转运方式

4、通路

5、临床结合

由于数据量庞大，图片较多，可以只看文字加粗内容。

开始：

1、发现并验证lncARSR。

通过lncRNA表达谱芯片找差异lncRNA。

定位：人9号染色体，包含了四个外显子（RACE技术），无蛋白表达能力。

苏尼替尼耐药的RCC细胞中lncARSR高表达。-确认相关

并且复发病人RCC组织中的lncARSR表达量高于对苏尼替尼敏感的病人。

部分使用苏尼替尼治疗后的病人，其肿瘤组织中的lncARSR表达会上升（可能产生获得性耐药）。lncARSR在苏尼替尼耐药的RCC中表达量高。说明lncARSR与苏尼替尼耐药有关。

2、为何在耐药细胞中lncARSR会上调？

LncARSR本身有3个DNA结合元件(DBEs)，而FOXO1、FOXO3a通过富集组蛋白去乙酰化来作为一个转录抑制剂。

在苏尼替尼耐药细胞中转染、FOXO3a能显著降低lncARSR水平。而将lncARSR的DBEs位点突变后，转染FOXO1、FOXO3a则不能影响lncARSR的表达。并且反过来，曲古抑菌素A（组蛋白去乙酰化抑制剂）和丁酸钠能消除由、FOXO3a引发的lncARSR转录抑制。

另外，ChIP分析表明, FOXO1、FOXO3a在lncARSR启动子区富集。而在苏尼替尼耐药细胞中，富集现象大幅降低（不能抑制lncARSR的转录）。

激活AKT可以诱导FOXO家族磷酸化并使其在胞浆中滞留，随之蛋白酶体降解。

敲减AKT能增加FOXO1、FOXO3a细胞核转位和表达，抑制苏尼替尼耐药细胞的lncARSR表达。

在苏尼替尼耐药细胞中，激活AKT，可以抑制FOXO1、FOXO3a，上调lncARSR。*

3、由第1部分内容可见，lncARSR与DCC苏尼替尼耐药有关。那么lncARSR是如何参与的？

通过苏尼替尼处理后，沉默掉耐药细胞的lncARSR能显著降低半抑制浓度,抑制非粘附性生长。

敲减lncARSR并用苏尼替尼处理耐药细胞后，能明显抑制STAT3、AKT、ERK通路，上调PARP(DNA修复蛋白)。表明了，敲减lncARSR可以修复耐药细胞对苏尼替尼的敏感。证实了第一部分内容。**

敲减lncARSR后，能恢复移植瘤对苏尼替尼的敏感。且不易复发。

这部分内容说明了lncARSR在RCC苏尼替尼耐药中起到了作用。耐药过程需要lncARSR参与。

4、首先，作者发现RCC病人血浆中的lncARSR水平要高于健康人血浆的表达水平。而肿瘤切除后，血浆中的lncARSR水平降低。而肿瘤复发后，血浆中的lncARSR水平又显著上升。这也就预示着，血浆中的lncARSR可能是有肿瘤组织中产生的。为后面一部分“转运方式”内容做铺垫，引入外泌体！

并且耐药细胞培养基中lncARSR水平要高于亲本细胞培养基的lncARSR表达水平。而RCC移植瘤小鼠血浆中的lncARSR水平也会变高。

LncARSR在进行性疾病的病人血浆中的表达水平要高。这预示着lncARSR跟临床相关。 

无疾病生存期与lncARSR表达量相关，如下图。

LncARSR低表达的病人，通过苏尼替尼治疗后，有非常好的无病生存期。

总之，高表达的lncARSR病人对苏尼替尼敏感度低。RCC病人LncARSR与苏尼替尼治疗有很明显的关联。所以作者认为lncARSR可以作为RCC病人是否可以苏尼替尼治疗的一个新的预测靶点。

5、接上述第4部分内容。作者想了解一下lncARSR在胞外存在的形式，毕竟lncARSR在培养基中存在。

作者用RNase处理RCC细胞的培养基，发现lncARSR水平并没有太大变化。而再加入TritonX-100（脂质溶解剂）后，lncARSR水平显著下降。说明胞外的lncARSR是存在于脂质膜内的。

接下来，引入了外泌体。

作者分离了外泌体，并通过外泌体标志物TSG101、CD9进行验证。

外泌体中的lncARSR水平跟培养基中总的lncARSR水平相当。

苏尼替尼耐药RCC细胞外泌体中的lncARSR水平要高于亲本细胞外泌体的lncARSR水平。

LncARSR转录本主要定位于胞浆中。lncARSR可以特异性结合不均一核糖核蛋白（，一个RNA结合蛋白，能通过结合特异性序列调控miRNA转运）。并且作者验证并确认了结合序列。

前期报道hnRNPA2B1能结合miR-198，并将miR-198带入外泌体。接下来，作者做了一个对比，lncARSR+miR198在外泌体中检测到的量与在细胞中检测到量的比值，发现它们的比值要远高于miR18a（阴性对照，不能被带入外泌体）。这说明了，lncARSR被hnRNPA2B1带入外泌体中。

hnRNPA2B1主要定位于细胞核。用hnRNPA2B1抗体拉lncARSR，发现在胞浆及外泌体中的含量很高。这也说明了hnRNPA2B1将lncARSR转运到外泌体中。并且这种作用关系，在苏尼替尼耐药细胞中的更高，也证明了第3部分内容。敲减hnRNPA2B1也能降低lncARSR在外泌体中的水平。

6、前期报道，细胞分泌的外泌体及包含物能被临近细胞接受。

用耐药细胞的外泌体孵育，能增加细胞内lncARSR的水平。

受体细胞通过跟标签外泌体孵育后，可以在绝大数受体细胞中看到标签。--lncARSR转入到了受体细胞

既然lncARSR被转移到了受体细胞了，那么耐药表型能否也同样被授予给了受体细胞呢？

用苏尼替尼耐药细胞跟亲本细胞共同培养，作者发现亲本细胞对苏尼替尼也变得不敏感了（也证明了第5点内容）。当然，敲减掉亲本细胞的lncARSR后，这个影响也会被消除。

为了验证是否是因为外泌体在表型传递中起到了关键性的作用。

作者通过RNAi或加入抑制剂的方式，使得培养基中的外泌体数量大幅减少（对细胞活性和胞内的lncARSR水平不产生影响），实验发现培养基中的受体细胞并未获得耐药表型。这说明了，外泌体在耐药表型传递过程中起到了关键作用。

苏尼替尼耐药细胞的外泌体能显著抑制RCC移植瘤对苏尼替尼敏感，并能提升肿瘤中的lncARSR的表达。

这部分内容说明了，耐药细胞外泌体可以通过细胞间传递lncARSR，使得受体细胞获得苏尼替尼耐药行为，实现了苏尼替尼耐药传播。

接下来，为什么上调lncARSR能提升RCC细胞对苏尼替尼耐受呢？

过表达lncARSR能使亲本细胞产生苏尼替尼不应性，并且激活生存相关通路。

7、前期报道，受体酪氨酸激酶（RTKs）在耐药中产生了很关键的作用。在耐药细胞中，敲减了lncARSR后，（均属于RTKs）的水平降低了。而在苏尼替尼耐药移植瘤及苏尼替尼治疗后复发的肿瘤中，AXL、c-MET表达上升。

另外，RCC亲本细胞与耐药细胞外泌体孵育后，其水平上升。而沉默了lncARSR后AXL、c-MET水平则下降。

同时敲减AXL、c-MET能消除lncARSR介导的苏尼替尼耐药。而分别敲减则产生的效果不明显。这表明了、c-MET两者参与了lncARSR介导的苏尼替尼耐药作用。

8、已经报道lncARSR主要定位于胞浆中，作为内源性竞争RNA隔离miRNAs，导致相应miRNA靶向的转录本释放。Ago2是RNA诱导沉默复合物的核心组件。

过表达lncARSR能导致Ago2增加在lncARSR的富集，但在AXL、c-MET转录本上大幅下降。敲减lncARSR后，Ago2能显著增加在的富集。这或许说明了lncARSR能竞争性结合基于Ago2的miRNA诱导抑制复合体，促进AXL、c-MET的表达。

生物信息学表明miR-34、miR-449可能有四个lncARSR和AXL、c-MET的miRNA应答元件。（ceRNA可以通过miRNA应答元件竞争性结合具有相同应答元件的的miRNA）

RIP实验拉下lncARSR相关的内源性miRNAs，发现、miR-449显著增加在RNAs的富集，这表明lncARSR和miR-34、miR-449间有特异性的作用。

转染能显著抑制psiCHECK2-lncARSR荧光素酶活性。

当敲减lncARSR后，、c-MET荧光素酶活性降低，但能被miR-34a海绵恢复。

这部分实验说明了lncARSR作为miRNA海绵作用吸附miR-34、miR-449，促进。

9、最后一部分，是结合临床相关。

RCC中锁核酸（一种经过修饰RNA）结合lncARSR能恢复对苏尼替尼的敏感

锁核酸能介导敲减lncARSR，并且能降低AXL、c-MET水平。

耐药移植瘤小鼠用锁核酸加苏尼替尼治疗，能恢复苏尼替尼敏感，并延长小鼠寿命。

作者用锁核酸处理前期通过苏尼替尼治疗获得性耐药病人肿瘤组织的移植瘤小鼠，发现lncARSR和、c-MET水平都有所下降。

BMS777607（c-MET抑制剂）和苏尼替尼同时作用，能显著抑制苏尼替尼耐药移植瘤的生长。但单独使用无此作用。另外这能阻止苏尼替尼耐药发生。这表明了lncARSR、AXL、c-MET可能会成为临床治疗的靶点。

好了，故事讲完。

That’s all. Thank you!

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